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Nature : DNA甲基化最新研究及常用研究方法

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发表于 2015-7-10 17:09:23 | 显示全部楼层 |阅读模式
     Joseph Ecker及同事在最新一期Nature发表研究结果:结合基因组dna测序,研究4个人的18种不同原生人体组织类型的DNA甲基化和转录组的全基因组图,实验数据及分析显示不同组织间CG点的甲基化普遍存在差异,而在调控序列上发生的甲基化一般与基因表达负相关。
     在研究过程中,该科研团队还发现了另外一个令人惊奇的现象。例如,他们发现许多区域显示出动态甲基化现象,而不是像人们一直认为那样,甲基化处于固定的位置,这些物质包括DNA启动子(promoter)的位置以及在启动子上游基因调控区。Ecker说:在过去,科研人员往往认为在启动子以及启动子上游调控区,任何的事情都有可能发生。但是他们的发现则表明,与基因转录相关的甲基化变化经常发生在启动子区域的下游。该发现可以指导相应的科研人员如何以及在什么位置寻找基因的甲基化,这对于研究个体基因调控这个方向的科研人员来说是意义巨大。
     另一个惊喜是,在基因组甲基化的层面上,广大器官是如何发生分化的。胰腺中的甲基化含量很低,而胸腺中的甲基化含量则很高。科研人员到现在还不知道原因何在。
     这项最新的研究仅仅触及了完全理解DNA甲基化模式这座大冰山的一角,还有许多的器官需要检测;对表观基因组的形状定型和改变因素仍有很多未知问题;有关不同的细胞在单个的器官中是否以甲基化形式进行分化这个问题仍待解决。


原文链接:
http://www.nature.com/nature/journal/v523/n7559/pdf/nature14465.pdf

基本背景:
   DNA甲基化在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下的CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶,是最早发现的修饰途径之一。原核生物中甲基化多发生在CCA/TGG和GATC序列;真核生物中DNA甲基化一般发生在CpG位点上;哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶,植物甲基化发生在CpG和CpNpG。甲基化会使胞嘧啶转为5-甲基胞嘧啶,CpG位点在基因组是不常见的,主要密集于接近基因启动子的位置,统称为CpG岛。CpG位点的甲基化可以对基因表现有重要的影响。
   DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因表达的调控。
   研究方法:
   目前,甲基化检测的主要研究方法是基于亚硫酸氢盐处理的甲基化特异性PCR(Methylation-specificPCR,MSP)和亚硫酸氢盐测序(Bisulfitesequencing PCR,BSP)。除此之外,还有高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting,HRM)和焦磷酸测序法。
   1、MSP法
   甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。

   该方法具有以下优点:
   1、检测灵敏度高,样品消耗少,仅需1μg的gDNA;
   2、快速、简单,省时;
   3、可结合Real-timePCR技术(Taqman探针)对样品中检测位点甲基化水平进行定量。
   2、BSP法
   亚硫酸盐测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶。最后对PCR产物进行测序,可以判断CpG位点是否发生甲基化。将PCR产物克隆至载体后进行测序。可以提高测序成功率,这种方法称为BSP-克隆测序法。

      该方法具有以下优点:

      1、特异性高:能提供高特异性分析结果,是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的;

      2、灵敏度高:可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的gDNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点。

      3HRM

高分辨率熔解曲线法,是近年来兴起的甲基化检测的新方法。在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物,这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化,用亚硫酸氢盐处理后,未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的GC含量发生改变,从而导致熔解温度的变化。




      4、Pyrosequencing

      焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是由4种酶(DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase))催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对,则会在DNA聚合酶的作用下,添加到测序引物的3'末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸测序检测法基于引物延伸的Pyrosequencing技术,通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程。通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析方法。

如果您有相关的实验需求,可以联系亿鸣复兴:
电话:18911058270;
网站:www.ymbio.com



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