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[共享] 酵母细胞表达系统

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发表于 2016-10-11 10:55:24 | 显示全部楼层 |阅读模式
       酵母表达系统是一种最经济高效的真核蛋白表达系统,可以成功实现胞内表达或是分泌表达,且其放大培养基相对廉价,培养条件要求不高,适宜工业放大。与哺乳动物细胞表达系统一样,酵母蛋白表达系统能够对所表达蛋白进行例如糖基化、酰基化、脂基化、磷酸基化等保证蛋白天然构象的修饰,可用于制备非常接近天然蛋白的具有高附加值的蛋白原料。
  武汉
金开瑞生物工程有限公司的酵母蛋白表达平台由多年从事酵母表达操作的实验人员组成,经验丰富,采用自行改造的高效分泌载体和宿主组合,可在最大程度上实现最高质量的蛋白表达。经客户反馈,以我平台所制备的蛋白原料为抗原所制备的单抗均具有很好的识别天然蛋白的优良特性。


一、服务特色
1、专利的Biobrick技术,可以实现高效体外构建任意拷贝的基因剂量,实现表达量的提高,可成功用于工业菌种的改良优化。
2、采用自行改造的高效分泌载体:pPIC9K、pPIC9K高效融合载体、pPICZA、pGAPZa、pPaSUMO3,宿主GS115、KM71、X33的正交组合。PINK系统优化分泌表达信号肽。胞内表达采用自行改造的载体pPIC 3.5k载体和宿主GS115、KM71、X33的组合,可在最大程度上实现表达。
3、高效的种子筛选工作能使您所定制的蛋白在最短的时间内获得尽可能高的产量。



二、服务说明
服务流程
  • 接受订单
  • 合 成
  • 纯 化
  • 分 装
  • 质 检
  • 发 货



客户提供

目的蛋白信息或基因序列,质粒或cdna(也可以选择由金开瑞提供);
蛋白询价信息表。

最终交付

对应合成量的引物冻干粉;
引物操作说明书。

三、服务周期

服务名称
服务项目
服务内容
交付结果
服务周期
服务报价
酵母蛋白表达服务经济型套餐
1.原核克隆
基因的获得
核酸电泳图片
2周
请询价
PCR扩增产物酶切连接到合适的载体
转化DH5α
重组质粒大量制备
线性化重组质粒
2.优化表达
电转化适宜的酵母宿主
酵母核酸电泳图
2-3周
请询价
从转化的平板上随机挑10株单菌落做PCR鉴定
3.表达及纯化
从PCR鉴定阳性菌落中选取一株做1L体系的放大表达
表达上清SDS-PAGE
1-2周
请询价
发酵液上清处理及一步纯化
最终纯化产物SDS-PAGE
及western blot
纯化产物SDS-PAGE及western blot
1L上清的纯化产物
酵母蛋白表达服务标准型套餐
1.原核克隆
基因的获得
核酸电泳图片
2周
请询价
PCR扩增产物酶切连接到合适的载体
转化DH5α
重组质粒大量制备
线性化重组质粒
2.优化表达
电转化适宜的酵母宿主
酵母核酸电泳图
5-6周
请询价
用遗传霉素G418进行多拷贝子筛选
对多拷贝子克隆进行RCR鉴定
选取40株多拷贝子进行小量诱导表达
最终种子表达上清
SDS-PAGE图
3.表达及纯化
选取表达情况最好的,根据客户需要放大表达
表达上清SDS-PAGE
1-2周
请询价
发酵液上清处理及一步纯化
最终纯化产物SDS-PAGE
及western blot
纯化产物SDS-PAGE及western blot
客户要求的蛋白表达量
专利的Biobrick技术用于酵母工业菌种改良优化
1.原核克隆
基因的获得
核酸电泳图片
2周
请询价
PCR扩增产物酶切连接到合适的载体
转化DH5α
重组质粒大量制备
专利的Biobrick技术体外梯度构建多拷贝基因剂量
2.优化表达
线性化重组质粒
酵母核酸电泳图
5-6周
请询价
电转化适宜的酵母宿主
对多拷贝子克隆进行RCR鉴定
选取40株多拷贝子进行小量诱导表达
最终种子表达上清
SDS-PAGE图
3.表达及纯化
选取表达情况最好的,根据客户需要放大表达
表达上清SDS-PAGE
1-2周
请询价
发酵液上清处理及一步纯化
最终纯化产物SDS-PAGE
及western blot
纯化产物SDS-PAGE及western blot
客户要求的蛋白表达量


四、案例展示

案例1:经济型套餐
  以下是通过我平台自行改造的pPIC9K载体和GS115宿主系统成功表达一种酶的经济型套餐实例。自接到订单至成功表达只用了20个工作日,亲和层析一步纯化得到蛋白纯度在95%以上。


案例2:标准型套餐
  以下是一个需要做优化表达的标准型订单服务,客户要求表达一种药用蛋白,最后做工艺放大,对表达量有一定的要求,客户自己做了大量的工作但是表达量一直提不上去,我们从上游开始做表达优化,用了50个工作日,用我平台自己改造的pPIC9K载体和KM71H宿主在2.5mg/ml的G418浓度下获得一株令客户满意的工艺放大种子。

Fig. C: Expression and secretion of pharmaceutical protein from P.pastoris.
Lane 1 :Expression level from customer.
Lane 2 :Expression level from Genecreate.
Lane 3 :Negative control.
Fig. D: Purification of the target pharmaceutical protein by SP-Sepharose.

案例3:工业菌株改良优化
  以下是我平台成功完成的一个工业酶菌种对产量的优化提高工作,利用专利的Biobrick技术一共用了近60个工作日由单拷贝基因剂量构建到8拷贝的基因剂量,表达量由开始的0.5g/L的水平提高到2.4g/L的水平,提高了近5倍。

        Fig. E: single copy gene expression of industrial enzyme from P.pastoris.
        Fig. F: eight copy gene expression of industrial enzyme from P.pastoris.
备注:我们只提供抗HIS标签抗体用于表达产物的质控,客户要求用对应蛋白的抗体做western blot,则抗体由客户自行提供。
  专利的Biobrick技术是集蛋白的高效表达和高活性于一体的新技术,以下是我们成功为一家知名公司开发的诊断试剂原料,经客户同意,我们公开下列数据:

N1
122
P1
19523
S1
266
N2
110
P2
22049
S2
4474
N3
231
P3
22342
S3
11371
N4
187
P4
22918
S4
24228
N5
105
P5
24117
S5
25865
N6
162
P6
23920
S6
26194
N7
128
P7
20396
CV1
25762
N8
129
P8
23952
CV2
25385
N9
111
P9
24398
CV3
26122
N10
136
P10
25177
CV4
25314
N11
196
P11
24194
CV5
24917
N12
172
P12
24018
CV6
26138
N13
220
P13
24922
CV7
25599
N14
139
P14
24965
CV8
26105
N15
201
P15
24959
CV9
25444
N16
176
P16
25123
CV10
26237
N17
528
P17
25811
CV
1.72%
N18
322
P18
25534
N19
157
P19
23840
N20
304
P20
24188

备注:以上是利用化学发光平台开发的试剂盒过SFDA的panel结果:
其线性相关性如下:




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