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什么样的lncRNA研究能登顶Science

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发表于 2016-11-15 11:34:06 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 mango 于 2016-11-15 11:42 编辑

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。LncRNA一直是研究的热点,其作用机制多元,并不像miRNA那样具有固定的模式,这也是研究的难点之一。
那如何去开展LncRNA研究呢?
在转录组研究中,研究思路不外乎高通量测序,差异表达分析,选择感兴趣的基因进行功能研究。在上篇推文中,作者实验加生信分析,做到功能预测这一步,就发了4.5分SCI,那如何发高一点,再高一点的SCI呢

今天就一起来看看Science上的lncRNA研究是如何做的。

文章案例
The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation
研究领域:免疫                   相关基因: lnc-DC,STAT3  杂志:Science                     IF: 34.661          PMID: 24744378                样本:GSE54143GSE54401

这篇文章主要探究lncRNA在树突细胞(dendritic cell,DC)分化及功能中的作用。作者发现了一个关键的lncRNA(lnc-DC),并用实验验证了其功能和作用机制,思路图如下:


图1  文章思路图(mono指单核细胞monocytes,DC指树突细胞Dendritic cells;DC由mono分化而来的)

那为啥就能发Science呢?
立意新
作者研究的是lncRNA在DC细胞分化和功能中的作用,在当时14年很少有lncRNA在免疫方面的研究。且2011诺贝尔生理学/医学奖授予的就是树突细胞研究者。树突细胞能递呈抗原,激发T细胞应答,可通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的树突细胞回输给病人,诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应,所以DC在肿瘤的免疫治疗中具有巨大的应用前景。
新发现  
作者发现了lncRNA在细胞质中一种新的作用机制,其直接结合信号分子来调节翻译后修饰,在当时拓宽了对lncRNA作用机制的认识。

系统实验
  最后还需要系统严谨的实验作为支撑。作者从最初lncRNA的筛选,验证,到目标lncRNA自身特性,表达和功能机制的研究,可以说在lncRNA的研究上已经很深入,也很系统。实验一环扣一环,正反证,反正证,真正是用实验结果堆出来的文章。

下面具体看下作者是如何一步步做lncRNA的研究的。
1  筛选lncRNA
作者首先用芯片HTA 2.0 transcriptome microarray assay检测了mono分化至DC过程中(7天)lncRNA的表达变化,在124个显著变化的lncRNA中(fold change>16,p<0.05),有24个被诱导。
图2  DC分化过程中lncRNA热图

为确保结果的准确性和可靠性,作者又用二代测序Illumina HiSeq 2000 检测了0点和第7天的lncRNA表达情况,99个lncRNA差异显著(fold>4,FDR<0.05)。

图3  二代测序lncRNA表达情况(红色为显著差异lncRNA)

对两个结果取交集,筛选了表达倍数高的lnc-DC作为下一步的研究对象。
2  验证lnc-DC
为确保结果的准确性,进一步用Northern blot对lncDC的表达进行了验证,确证lnc-DC在DC分化过程中的高表达。在验证这一步,还可以选择qPCR,两者各有优缺点,可以自行选择合适的方法。

图4 lnc-DC的Northern blot验证结果

3  Lnc-DC自身特性研究
可对目标lncRNA进行基因组定位,序列保守性,全长及结构等方面进行研究。

基因组定位

可用Genome browser对lnc-DC进行基因组定位,并查看其临近基因。调控邻近基因表达是lncRNA的一种作用机制。
Genome browser    http://genome.ucsc.edu/
序列保守性估计
可用PhastCons进行序列保守性估计。PhastCons      http://genome.ucsc.edu/

图5  lnc-DC和邻近基因HEATR6序列的保守性估计

转录起始位点、结束位点及全长验证
可用RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证

图6 RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证结果

结构解析
可用RT-PCR进行5‘端和3’端结构探究,发现lnc-DC有poly A尾和5‘端帽子。

图7 RT-PCR验证lncDC结果

编码能力验证
将lnc-DC转入HEK293T细胞进行表达验证,其无编码能力,同时用生信方法对其序列进行编码能力预测,与实验结果一致。
Coding potential calculator http://cpc.cbi.pku.edu.cn/programs/run_cpc.jsp

图8 lnc-DC编码能力验证结果(左,片段构建;右,免疫印迹结果)

4  表达研究
    表达特异性作者选取其他免疫细胞进行比对,分别通过实验及数据库中的数据分析,发现lnc-DC只在cDC(conventional DC)中特异性表达。

图9 lnc-DC在不同细胞中表达结果

表达机制研究
组蛋白修饰可调控基因表达,作者采用CHIP-seq和CHIP-qPCR进行组蛋白修饰研究,并通过dnaase I 的敏感性来衡量染色质的疏松状态。
在lnc-DC位点组蛋白H3K4me3和H3K27ac修饰,染色质较为疏松的状态及转录因子PU.1促进了lnc-DC在cDC中的特殊表达。
   
图10 lnc-DC表达机制研究结果

5  Lnc-DC功能研究
功能探索
作者通过RNAi敲除过表达lnc-DC来研究其功能,敲除和过表达结果相反。敲除lnc-DC后,作者分别从基因、蛋白的表达及功能的影响来考察lnc-DC的功能。
最后表明lnc-DC促进了DC的分化,对DC抗原的递呈及增加T细胞增殖上具有重要作用,同时小鼠体内外实验也有相同结论。

图11 lnc-DC RNAi基因表达结果

图12 lnc-DC RNAi蛋白表达结果

图13 lnc-DC RNAi后DC抗原递呈能力(左)及激活T细胞增殖情况(右)

机理研究
在机理研究中,可用排除法,先考察是否和目前已经报道的作用机制一致。

LncRNA的作用机制中,其中有cis顺式调控和trans反式调控。Cis顺式调控影响邻近基因的表达,在之前的实验环节,发现lnc-DC敲除对邻近基因表达没有影响。

接下来作者用FISH对lnc-DC进行细胞定位,显示lnc-DC处于细胞质中。LncRNA在细胞质中有两种作用方式,可作为ceRNA与miRNA结合恢复mRNA的翻译,或与ALU元件作用促进STAU1介导的mRNA衰退。RNA免疫沉淀 (RIP)表明lnc-DC不与AGO2作用,排除了lnc-DC和miRNA的作用机制。用生信分析表明lnc-DC没有与ALU的作用序列,所以lnc-DC有新的作用机制。

作者用pull-down(蛋白质体外结合实验)联合MS发现lnc-DC与STAT3(转录因子)相互作用,并用系列实验找出了lnc-DC和STAT3的作用位点及调节方式,详细过程请参见文献。
下图是作者推测的lnc-DC的作用机制模拟图。

图14 DC分化过程中lnc-DC的作用机制模型

在mono分化至DC的过程中,组蛋白H3K4me3和H3K27ac的增加伴随着染色质的疏松,促进转录因子PU.1的结合,增强了lnc-DC的表达。lnc-DC转录后即转运至细胞质,与STAT3结合,阻止了SHP1对STAT3的去磷酸化,增强了STAT3的信号通路,最终促进了DC细胞的分化。 在这简单梳理了作者的研究思路,从lncRNA的筛选,验证到功能机理研究,详细可参见文献。

这篇文章对我们有什么启发呢?
首先立意一定要新,想想有什么热点是可以与自己的研究方向结合的。其次是严谨的思路和系统的实验,这些是完全可以参照和套用的。14年lncRNA研究的science的标准在这,请大家用心体会……   


LncRNA研究方法总结   
LncRNA筛选
芯片
Humam transcriptome microarray assay 2.0
Mouse transcriptome microarray assay 1.0


测序

LncRNA验证  
Northern blot/qPCR

目标lncRNA研究  
基因组定位 Genome browser     http://genome.ucsc.edu/
序列保守性估计PhastCons       http://genome.ucsc.edu/
转录起始位点,终止位点验证及全长克隆  RACE
结构解析  PT-pcr
编码能力预测  转基因-免疫印迹
  
LncRNA表达
表达特性   
Northern blot/qPCR      
数据库数据


表达机理
组蛋白修饰——CHIP-seq/CHIP-qPCR
染色质状态——DNAase I
序列分析
LncRNA功能
敲除/过表达RNA
免疫印迹(RIP)
Pull down实验
……

知识拓展

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