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llumina高通量测序平台

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发表于 2011-6-8 11:20:49 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 美吉生物 于 2011-6-8 11:26 编辑

llumina高通量测序平台

Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发,利用其专利核心技术“dna簇”和“可逆性末端终结(reversible terminator)”,实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。Illumina公司于2007年花费6亿美金的巨资收购了Solexa,就是为了促成Genome Analyzer的商品化。Genome Analyzer作为新一代测序技术平台,具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势,可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及
功能基因组学(基因表达及调控、基因功能、蛋白/核酸相互作用)研究。


实验流程

1、
制备文库


将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的小片段,并在两个末端加上接头(adapter)



2桥式PCR产生DNA

利用专利的芯片,其表面连接有一层单链引物,DNA片段成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。引物扩增使得单链DNA成为双链,该双链变性后成为单链,其一端“固定”在芯片上,另外一端(5’3’)随机和附近的另外一个引物互补,也被“固定”住,形成“桥(bridge)”。反复30轮扩增,每个单分子得到了1000倍扩增,成为单克隆“DNA簇”













3可逆化学阻断技术测序

利用边合成边测序(Sequencing by synthesis)的原理,加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是可逆终止子,因为3’羟基末端带有可化学切割的部分,每个循环它只容许掺入单个碱基。去除其他多余的dNTP后,用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。随后将这些基团化学切割,恢复3’端粘性,继续聚合第二个核苷酸。如此循环,直到每条模板序列都完全被聚合为双链。统计每轮收集到的荧光信号,就可得知每个模板DNA片段的序列。

4、
数据分析


自动读取碱基,数据被转移到自动分析通道进行二次分析。



技术优势


新颖的测序化学技术


Genome Analyzer利用新颖的可逆荧光标记终止子,可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在,自然竞争减少了掺入的误差。


可扩展的高通量


Genome Analyzer系统每次配对末端运行后可以得到超过20Gb的高质量过滤数据。这个技术的可扩展性保证了更高的数据密度和输出,能用更少的经费完成更复杂的项目。


需要样品量少


Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中,如免疫沉淀、显微切割等。


简单、快速、自动化


Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。样品文库制备可以在几小时内完成,一个星期内就能获得高精确度的数据。由独立软件控制的自动生成DNA簇的过程可以在5h之内(30min手工操作)完成。自动化的流程不需要进行油包水PCR,减少了手工操作误差和污染的可能性,不需要机器人操作或洁净室。快速地实验流程使Genome Analyzer的能力增至最大,而自动化降低了项目的时间和费用。


单个或配对末端支持


Genome Analyzer系统支持单个片段或配对末端文库。文库构建过程简单,减少了样品分离和制备的时间。制备基因组DNA的单个片段或配对末端文库需要6h,手工操作只需3h


平台优势


灵活的平台


针对不同的应用,可选择是否将不同的读取长度和对读测序技术相结合。


高质量的测序数据


在每个流动槽中对数百亿到数千亿碱基进行准确的碱基识别。


应用广泛


SNP和结构变异检测、(de novo)组装、转录组测序、甲基化检测。


高效的样本制备


高速自动化工作流程以及低样品量要求,可在不到一周的时间内生成数据。


技术应用


转录分析



mRNA测序(RNA-Seq)

一次mRNA测序实验即能快速生成以完整poly-A为尾的RNA完整序列信息,并分析基因表达、cSNPs、全新的转录、全新的异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录。


Small RNA深度测序

Small RNA测序能够测定来自不同有机体任意大小的小RNA序列,在一份样品中能同时分析4百万小RNA,是目前可应用的最广泛且最具深度的小RNA检测方法。Small RNA测序记录了文库群体中序列的数字频率,因此消除了本底信号。

数字化基因表达谱分析

数字化基因表达谱通过高通量测序代表每个基因的21bp标签(tag)来快速、全面的检测一个物种特定组织在特定条件下的基因表达情况。因为标签测序无须测定表达基因的总长度,其总读取更少,敏感的更高,研究人员可在近乎不受限制的范围内调节覆盖的深度,完成罕见的转录识别和定量。

基因调控和控制


Illumina ChIP-Seq整合了染色质免疫沉淀(ChIP)和海量平行DNA测序技术,可准确且低成本的识别和蛋白结合的DNA位点,ChIP-Seq技术为ChIP蛋白和修饰的研究提供了强大的技术支持。

ChIP法利用抗体中特定的蛋白,特异富集性交联的DNA-蛋白质复合体。然后将寡核苷酸接头与特异性蛋白结合的DNA延伸拼接,从而可进行海量平行测序,按照片段大小进行选择后,使基因分析仪和Illumina测序技术对生成的ChIP DNA片段测序,与低分辨率的ChIP芯片技术不同,ChIP-Seq经一次测序就准确的进行全基因组的关联分析。

多重测序

Illumina提供多重样本制备寡核苷酸试剂盒、多重测序引物和PhiX对照试剂盒,能在DNA片段中引入标记序列(tag),从而实现在一个流动槽上对96种不同的样本同时进行测序。在保证低错误率和读取长度条件下,极大地提高了实验的可拓展性。尤其在研究某段区域或小基因组时,多重测序更具价值。
发表于 2011-8-4 21:16:11 | 显示全部楼层
?   现在好像华大基因蛮多这些仪器
发表于 2011-8-8 11:11:38 | 显示全部楼层
是第二代测序平台吗?
发表于 2011-8-9 08:58:13 | 显示全部楼层
收藏了{:2_26:}
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