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磁珠微卫星富集文库的构建

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发表于 2011-8-29 22:13:14 | 显示全部楼层 |阅读模式
微卫星由于分布广泛,具有丰富的多态性、共显性等特点而被广泛应用于分子遗传学、法医学、生态学等各个领域,因此对于微卫星位点的识别是各学科研究的迫切需要。在中国科学院北京基因组研究所基因组科学与信息重点实验室胡松年研究员的指导下,博士生耿佳宁、李克欣等开发了一种利用构建磁珠富集文库来获取新物种或者稀有物种的微卫星位点的方法。
本文构建的磁珠富集文库方法具有高效富集微卫星dna的作用,我们在传统的富集方法的基础上做了一些改进,具体改进和方法的优缺点如下:
首先,用超声破碎基因组DNA是本方法的一个主要的改进。传统富集文库的构建常用酶切的方法得到基因组DNA片段,其片段长度依赖于基因组DNA的G+C含量和酶切位点的分布,因而得到的片段有偏向性,而且在基因组上分布也不均匀。当然,也有一些研究者注意到这个问题,并且提出了用多种内切酶共同切割基因组DNA的方法。此方法可以产生比较理想的片段,得到足够的侧翼序列来设计引物,但是如果用多酶切会产生不是平端的酶切产物,产物需要进行末端补平。而且这个方法可以产生多拷贝的一些片段,克隆后有很大一部分克隆含有相同的插入片段,因此减少了有用的微卫星位点的数量。而本文采用超声的方法可以克服酶切方法的这些不足,还可以根据实验需要的DNA片段大小选择超声的条件,并且用超声的方法可以节省时间,对温度也没有特定要求,且由于是随机切割,不会完全损害某一类微卫星。只要控制一定的功率和时间,片段大小就基本确定,不需要进行预实验。
杂交是本方法改进的另一个步骤。本文的方法用了二次杂交,第二次的杂交温度比第一次提高了2-3度。采用严格的二次杂交,可以去除第一次杂交中的非特异DNA片段,明显提高了阳性克隆率。在文库构建过程中,杂交、亲和捕捉得到单链DNA之后进行了一次PCR, 而且对PCR的循环数也做了严格的预实验,挑选合适的循环数,这样就避免PCR扩增改变基因组本身的微卫星位点的含量和各种类型微卫星之间的比例关系。这些改进使得我们能够高效、快速构建出稳定性好的微卫星富集文库。
通过构建微卫星富集文库和对微卫星位点多态性验证,最终筛选出高原鼠兔的13对多态性信息含量较高的微卫星位点。同样,也得到了中国地鼠16对高度多态的微卫星位点。分析结果表明我们建立的富集文库流程能找到用于遗传学、生态学等领域的多态性微卫星标记,并且可以通过多态性分析软件进行后续的种群遗传学和生态学分析。
当然我们建立的磁珠富集文库的方法也有缺点,这个方法容易破碎AT区域,而且在我们构建的几个文库中没有找到GC重复的微卫星位点。造成GC位点不容易得到的原因可能是我们杂交的温度没有调整好或者是GC区域存在着二级结构,所以我们的方法有待进一步完善。
文章全文发表在《基因组蛋白质组与生物信息学报》2010年第1期,网上全文可在Elsevier出版集团的ScienceDirect数据库(www.sciencedirect.com/science/journal/16720229)浏览下载。
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